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問題解答

最常見問題

Q:用于PinpoRNA正常探針設計的待測序列最短需要多少堿基?

A:PinpoRNA探針通常用于檢測長于300堿基的mRNA/ncRNA。為了保證一個拷貝的靈敏度,通常會需要1000堿基左右并設計15組以上的探針。短的目標序列(<300nt)也可以設計,但可能會影響靈敏度。針對miRNA的探針可以檢測17-50堿基,但靈敏度會受影響,詳詢技術支持。

Q:做這個實驗我需要準備些什么?

A:做PinpoRNA原位檢測,需要PinpoRNA專用探針和至少一種試劑盒。探針包括目標探針,陰性探針,以及本物種的陽性探針(高表達內參基因)。試劑盒則因應需要有多種可供選擇。 還需要PinpoRNA專用的核酸原位雜交儀(SH-08)??梢灾蠓袩镆后w的加熱器,以及專用的疏水筆。以及一些常用的組化試劑和配件(脫蠟試劑,核染試劑,封片劑,超純水,洗缸,燒杯,玻片架等等)。

Q:PinpoRNA原位雜交和普通的免疫組化在流程上有什么關鍵的不同之處?

A:主要有以下不同之處: ①在預反應液Bplus高溫修復后無需冷卻。請直接將片子浸入常溫純水中洗滌。 ②過程中有消化酶步驟進行消化,請注意,共染時該步驟有可能對目標蛋白造成傷害。 ③必須使用核酸原位雜交儀(SH-08),用以保持雜交所需溫度的同時保持雜交環境的濕度以阻止雜交液揮發。 ④應按手冊要求使用合適的封片劑。 ⑤化學顯色的核染試劑使用Gill’s Hematoxylin I。或將其稀釋一倍使用。 ⑥必須使用指定的疏水筆(Vectorlabs,貨號:H-4000)。

Q:樣本要如何固定?使用4%多聚甲醛(PFA)還是10%中性福爾馬林(NBF)?

A:醫療系統常規的病理切片制作方法均可滿足實驗要求。對于FFPE樣本而言,大部分樣本應及時用新鮮的10%NBF(neutral buffered formalin)在常溫固定16-32小時。不建議在4℃固定。小于16小時會固定不足,超過32小時導致的過固定會讓信號難以檢測。石蠟切片建議厚度為5±1μm, 經固定冰凍切片7-15μm,新鮮冰凍切片10-20μm。

Q:需要做對照嗎?

A:PinpoRNA強烈建議每次實驗做某例樣本的至少三張連續切片:分別是做目標基因,陰性對照探針,陽性對照探針。陽性對照探針通常是本物種的高表達內參基因,用于檢驗樣本的RNA降解程度是否合適用于實驗。陰性探針通常使用細菌的DAPB探針(也可指定別的)用于判斷樣本本身有無產生干擾信號導致假陽性。

Q:實驗有哪些關鍵步驟要注意?

A: ①不論樣本面積多小,疏水圈圈內面積大小必須至少15x15mm。探針雜交液使用體積(滴數)嚴格按照手冊。以免因為長時間雜交導致水分揮發/雜交液鹽濃度升高,最終雜交失敗。 ②消化酶步驟開始后,任何情況下不要讓樣本干燥,包括肉眼不易察覺的干燥。比如多片實驗時,應滴加雜交液后擺放好再處理下一張片子,而不是將所有甩干的片子在雜交儀上擺放整齊后才逐一滴加。以及雜交儀上的所有8個水槽均應加水以保持環境濕潤。 ③即用型探針、反應液1、反應液2、反應液3(或反應3稀釋液)使用前需預熱溶解所有沉淀并混勻。 ④50×洗液和25×預反應Bplus在運輸和儲存時會有沉淀,使用前先預熱溶解沉淀。 ⑤不要改變步驟順序。按照實驗手冊確保每一步使用正確的試劑。使用指定的疏水筆和防脫玻片。

Q:如何組合探針進行多通道檢測?

A:將濃縮探針,按比例稀釋入即用型探針雜交液中即可得到混合探針使用。也可以將濃縮探針加入探針雜交液(單獨購買)中,即可用于雜交。 多通道檢測時,通常需要混合不同型別的探針(I/II/III型)才能在一張片子上分別顯色。 試劑盒附贈的陰陽對照探針通常是已經混合好不同型別的探針,可直接使用。

Q:多通道實驗中如何跳過某個通道?可以完全不加任何探針嗎?

A:忽略用于該通道的反應3步驟以及底物標記步驟即可。2小時的探針雜交反應可以只使用探針雜交液不加任何濃縮探針。請注意各試劑盒需配合使用的探針型別。

Q:整個實驗在哪一步可以暫停?

A:有好幾個暫停點,但建議盡量一次性做完。 ①切片后石蠟切片可以烤片15分鐘后凍存于-20℃大約3-12個月或室溫密封干燥保存1-3個月。冰凍切片應密封保存于-20℃(最好-80℃)不超3個月。 ②畫完疏水圈后,可室溫或冷藏干燥過夜,第二天使用。 ③探針雜交做完后,將片子室溫浸泡在5xSSC中過夜,第二天用1x洗液室溫洗兩次后接著使用。

Q:需要什么配置的顯微鏡?

A:熒光試劑盒需配合熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡,并使用正確的濾光片?;瘜W顯色試劑盒只需明場顯微鏡。

Q:PinpoRNA的信號通常是什么樣?看到的“點”代表什么?

A:典型的RNA原位雜交信號呈邊緣清晰的圓點狀,每一個圓點都代表此處有至少一個拷貝的RNA分子。

Q:點的大小深淺代表什么?

A:點的顏色深淺和大小和多因素有關。比如設計的目標探針組有多少組結合于目標序列,底物顯色時間,酶的活性。但比起大小和深淺,點的數目是拷貝數的最直接反映,因為一個點就至少一個拷貝。

Q:影響信號的關鍵因素是什么?

A:控制雜交的溫度和濕度是實驗成敗關鍵。請務必使用我們推薦的雜交儀以保持最佳的實驗結果。消化酶消化也是影響實驗結果另一主要因素。消化不足導致信號減低或背景。消化過度會破壞組織的形態或RNA丟失,因此要優化此步驟時間與濃度。

關于PinpoRNA新一代原位雜交試劑

Q:新一代原位與傳統的原位雜交有什么區別?為什么要用新一代試劑?

A:傳統的原位雜交通常使用一段較長的探針(至少幾百堿基),直接雜交于待測核酸,通過該探針上的地高辛或熒光標記觀察信號,因此通常無法和同家族基因相區分,對位點的變異也不敏感,因為標記物數目太少所以檢測靈敏度較低。尤其當待測的是mRNA時,由于mRNA大多處于一定的降解(片段化)狀態,傳統長探針無法雜交結合,因而檢測不到或特異性很差,這也是幾十年來一直沒有RNA原位雜交商業化試劑盒的原因。 新一代的原位雜交,大都采用了短探針(20-50堿基),可以很好地結合即使有一定片段化的RNA序列,且產生的信號都經過線性放大系統進行放大,可以很好的解決傳統原位雜交的特異性和靈敏性問題,真正做到商業化的通用檢測。

Q:PinpoRNA雜交檢測試劑和進口同類產品有什么區別?

A:我們的探針系統已經申請了中國專利,相比于進口試劑,它可以很好地解決多探針結合時,產生的效率低下的問題,提高檢測靈敏度。另外在放大系統上開發了一套專利的高效線性放大系統,這套放大系統,同樣提高了放大效率,因此比進口試劑操作簡單,步驟更少,但可以實現更高的信噪比結果。此外,由于這套雜交信號放大系統,并不依賴于任何蛋白質的生物學活性,只依賴于核酸序列的物理化學性質,因此PinpoRNA在檢測過程中受到的環境干擾要比其他基于蛋白/酶學功能的等溫擴增試劑小得多,在操作上更方便結果更可靠。

Q:試劑可以用于檢測哪些RNA/DNA?

A:理論上長度大于100堿基的核酸序列都可以檢測,但由于檢測靈敏度和探針覆蓋的核酸序列長度成正比,通常至少500-1000堿基長目標序列才能保證最佳的檢測靈敏度。

Q:新一代原位雜交盒為什么比傳統試劑昂貴?

A:我們采用的是幾十條HPLC純化的高純度短探針,并配以放大系統,因此在成本上要比傳統的單一標記長探針高很多,但換來的是高質量的特異性和靈敏度(信噪比)。

Q:是否提供檢測服務?

A:可以提供。請聯系代理商咨詢。

Q:試劑盒有現貨嗎?貨期保質期多久?

試劑盒長期現貨,且贈送底物,熒光試劑盒(不含熒光底物)保質期為1年,化學試劑盒保質期為9個月。定制合成的探針貨期2-3周。

Q:PinpoRNA 1.0和2.0有什么區別?

A:2.0版改進了樣本前處理,方便實驗條件優化,能保持更佳的組織形態。在信號強度上,顯著優于同類試劑,信噪比更高。

Q:試劑盒可以檢測細菌/真菌/病毒嗎?

A:可以。詳見探針設計部分或聯系技術支持。

Q:我可以只買探針不買試劑盒自己做雜交嗎?或者只買試劑盒自己設計探針嗎?

A:都不可以。我們的探針和試劑盒是配套使用的,客戶無法自行完成。

關于探針的設計

Q:探針可以自己設計嗎?為什么有不同型別?

A:由于探針的復雜性,我們會為客戶設計探針??梢杂貌煌臒晒夥肿訕擞洸煌蛣e的探針,如此在同一張片子上實現多色檢測。

Q:為什么購買探針前要和技術支持溝通,類似進口試劑一樣直接根據探針貨號下單不可以嗎?

A:客戶經常會對探針的設計提出個性化需求,因此只根據貨號下單并不能確保該探針滿足您的需要。購買前與技術員詳細溝通可以確保得到自己所需要的探針。比如有時候需要該探針檢測所有剪接體,有時候只檢測某些剪接體,有時候需要跨物種通用檢測,有時候要保證物種特異性,這些都必須詳細溝通。和進口探針不同,通常情況下品博易視的探針會保證其在家族基因中的檢測特異性,而不會只根據該基因本身的標準序列進行機械式設計,這在某些有很多家族成員的基因時非常重要否則檢測結果將來自多個家族基因!

Q:購買探針或進行設計時需要提供什么信息?

A:請至少給出物種,基因名稱,Gene ID。 可以指定某reference sequence,并告知檢測目的,比如是否針對某剪接體,針對某段敲除序列,是否跨物種,以及是否做過qPCR驗證及qPCR擴增區以便我們將探針覆蓋此區進行驗證實驗。當有多個基因時,可以給出希望如何組合檢測這些基因。我們會及時反饋設計可行性及方案,此服務免費。

Q:公司可以告知客戶具體的探針序列嗎?

A:基于商業考慮,我們無法給出每一條探針的序列,但我們會給出所有探針覆蓋了待測基因的哪些具體的區域。連同貨號信息,可以放在文章中發表,對于新一代原位雜交方法,雜志編輯部均可接受。信息可在網頁查詢或聯系技術支持。

Q:探針設計需要多久,多久可以到貨?保質期怎么樣?

A:設計溝通通常24小時內即可完成(全年無休)。非現貨探針約2-3周到貨?,F貨探針隨時發貨。探針如按要求使用儲存,我們保證有效期從收貨之日起至少12個月,最長可以保存24個月。

Q:探針是否可以用于其他公司的試劑盒,或者反之?

A:不可以。我們公司探針/試劑盒都只能自行配合使用。

Q:探針是否額外收取設計費用?

A:目前針對人/大鼠/小鼠/斑馬魚的任何探針不收取設計費用,不論是否定制設計合成,所有探針均一目錄價。

Q:你們的探針是用什么基團標記的?

A:都是短的DNA探針,并沒有任何標記。

Q:如何保證探針的特異性?特異性的基本原則是什么?

A:PinpoRNA每一條探針均有三個結構域,一部分結合于目標基因,一部分和組內探針結合,一部分結合于放大系統。通過每組探針2-4條同時雜交于指定區域實現檢測,而這幾條探針同時結合于非特異位點的可能性小于百萬分之一。通常情況下,每一個目標基因我們會設計15-20組探針用于檢測以達到單拷貝的靈敏度。此外,不同于其他公司的探針,我們的探針設計時充分考慮了家族基因/同源基因的干擾,因為有些家族基因有很高的同源序列。通常情況下,如果沒有特別指定,我們會盡量同時檢測所有剪接體。

Q:如何保證探針/試劑盒的檢測靈敏度?

A:PinpoRNA有專利的放大系統,在覆蓋正常長度的待測序列和樣本為培養細胞時,通??梢赃_到單拷貝的靈敏度。如果有需要特別增加靈敏度,可以通過增加探針以覆蓋更長的目標序列來實現,但會涉及額外費用。

Q:不同基因的探針是否可以混合使用?

A:可以混合使用,這樣測出來的信號來源于所有基因。

Q:檢測微生物(細菌/真菌/病毒)的探針都可以設計嗎?有什么要求?

A:微生物的特異檢測通常取決于有沒有特異的序列可以用于區分該物種。 對于病毒,由于不同病毒之間的序列通常差別很大,因此設計探針檢測某類病毒是可以做到的。如果要區別病毒亞種,則要詳細分析亞種間序列的差異,通常也都可做到。 對于細菌和真菌,情況比較復雜,由于種屬間rRNA序列的高保守性,針對rRNA設計的探針通常只可用于某一類型的細菌/真菌檢測,無法做到種間甚至屬間的區分。如果要針對某一“種”進行特異檢測,則必須提供經驗證的該”種”的特異序列來設計探針,此序列必須由客戶負責提供,我們公司僅負責設計的探針可以完美檢測該序列,而無法保證其他‘‘種’‘是否因為也有該序列或高度同源序列而被檢測到。

Q:植物/特殊物種的RNA檢測探針可以設計嗎?

A:可以,和哺乳動物的探針設計沒有本質區別。

Q:LncRNA可以檢測嗎?

A:100堿基以上的通??梢浴?

Q:MirRNA可以檢測嗎?

A:可以。但mirRNA由于序列較短,通常不容易保證探針對其家族成員的特異性。因此如有特異性的疑問,客戶應自行準備家族不同成員的合適陽性樣本,驗證所合成探針的檢測特異性。PinpoRNA目前無法一一驗證承諾。

Q:點突變可以檢測嗎?

A:目前不提供。

Q:環狀RNA可以檢測嗎?

A:目前不提供。

Q:不同剪接體可以區分嗎?

A:有些可以,需要具體情況具體分析,請于下單前溝通好。

Q:PinpoRNA的探針是如何QC的?每一個目標探針均經過原位雜交驗證嗎?

A:PinpoRNA的探針均按特定的寡核苷酸參數標準設計,和通常的PCR寡核苷酸相比,除了引物序列和退火溫度可以保證以外,還進一步規范了在PinpoRNA雜交條件下的最佳序列和純度,保證最低可能的非特異雜交產生。新合成的探針并不會一一驗證,主要是因為這些都是化學合成的普通無修飾寡核苷酸引物,根據其合成的退火溫度已經可以精確計算出探針的雜交溫度。但所有現貨探針均已經過客戶/公司原位雜交驗證。

Q:PinpoRNA的探針可否用于跨物種檢測?

A:主要取決于跨物種序列的相似度。如果大于95%則通??梢?。請聯系技術支持。

關于樣本制備與處理

Q:什么樣本可以用于做RNA原位雜交?什么樣本不可以?

A:如果一個樣本可以完美“固定“于某基質(如玻片)上,即可以做RNA原位雜交,反之則不行。比如石蠟切片冰凍切片組織芯片都可以做,但液體樣本中的RNA就無法檢測。但諸如血液樣本等,則可以做成細胞涂片方式解決。整胚樣本也是可以的。

Q:石蠟切片冰凍切片制作有什么特殊要求?

A:按常規的制片方法即可,沒有特殊要求。但應盡可能地防止RNA的降解,及時將樣本用甲醛或多聚甲醛固定。

Q:樣本處理過程如何影響實驗結果?

A:主要是RNA降解程度會影響實驗。在取樣后快速清洗/灌流,然后應及時固定一定時間(12-36小時)。但甲醛或多聚甲醛固定太久(>3天)也會造成RNA不易檢測。

Q:保存多久的樣本還可以用于實驗?

A:經過固定的石蠟樣本塊在低溫(4度或凍存)可保存較長時間。無固定的冰凍樣本則一般只可以保存幾個月。

Q:石蠟樣本/切片應如何保存?

A:石蠟塊應盡可能在4度或凍存。 切片后應完全晾干后60℃烤片30-60分鐘,凍存于-20℃。但隨著保存時間的增加,RNA也會緩慢降解,保存時間和轉錄水平高低有關。

Q:冰凍樣本/切片應如何保存?

A:應-80℃凍存。尤其未經固定新鮮樣本,應避免凍融,新鮮未固定切片一旦凍融一次,RNA即嚴重降解。

Q:細胞樣本應如何保存?

A:甲醛或多聚甲醛固定后梯度酒精脫水,保存于-20℃。詳見實驗手冊。

Q:用于檢測服務的樣本應如何運輸?用于檢測服務的樣本有什么要求?

A:經過甲醛或多聚甲醛固定的樣本可以用冰袋和泡沫箱運輸。未經固定的必須全程干冰運輸(切片不建議運輸)。

Q:整胚樣本(比如斑馬魚/小鼠胚胎)可以做嗎?要怎么處理?

A:可以做。處理方式多樣,根據處理方法不同,后續應采取不同方法暴露待測RNA。

Q:骨組織可以做嗎?

A:可以,必須用建議的快熟脫鈣液脫鈣,防止脫鈣過程RNA的降解。

Q:樣本為什么會脫片?

A:固定不足,包埋滲透不好,未干透即烤片,未使用防脫玻片等都會造成脫片。

關于實驗操作

Q:玻片雜交儀是必須的嗎?可以用水浴鍋/恒溫箱代替嗎?

A:做石蠟和冰凍切片必須使用我們推薦的玻片雜交儀(比如品博易視的SH-08)。不可以使用水浴鍋或者恒溫箱。

Q:煮沸修復步驟可以象免疫組化一樣用水浴鍋或微波爐嗎?

A:不可以使用微波爐或電磁爐??梢允褂盟》椒ǎ垏栏癜凑账⌒迯偷牟襟E進行。參見手冊。使用水浴時溫度很難達到99-100℃,如果使用水浴鍋,必須用溫度計伸入1×B plus修復液中直接測量溫度,確認達到99℃以上方可使用。使用水浴鍋時,由于長時間加熱方能達到99℃,要防止1×B plus修復液因蒸發被過度濃縮。

Q:疏水筆可以用別的牌子嗎?

A:別的牌子的免疫組化使用的疏水筆在本實驗中通常都會出現疏水圈脫落的情況。因此請一定使用指定品牌(Vectorlabs,貨號:H-4000)。

Q:玻片類型可以隨便選用嗎?

A:必須用高質量的防脫玻片,有些防脫玻片雖然防脫但會造成背景信號。

Q:用進口密封型雜交儀有什么注意事項?

A:用進口密封型雜交儀時使用的雜交液可以減少1/3使用量。機器應全程保持40℃度不關機或中斷。由于看不見玻片上的液體狀態,放入機器時應小心平穩,避免液體流出疏水圈??赡艿脑挘南抡掌?,比較雜交前后疏水圈內雜交液體是否明顯減少。

Q:用開放式雜交儀有什么注意事項?

A:機器應全程保持40℃度不關機或中斷。蓋子上應放上濕紙條。疏水圈內應滴加足量雜交液(見手冊)??沼嗖F恢庙殧[放空白玻片并畫圈后滴上足量水,目的是要盡量保證雜交時空間內的濕度。

Q:實驗用的試劑必須經DEPC處理或者保證無Rnase的嗎?(比如RNase free PBS?)

A:建議樣本在固定前的清洗處理和切塊時應遵循無RNase環境的原則,一旦正確固定后,RNA通常不會受實驗手冊所述步驟導致降解。因此MilliQ水(超純水,18.2M?)即可,可以不需要DEPC水。

Q:雜交溫度要很準確40度嗎?

A:是的,雜交溫度對實驗的特異性很重要,可以40±1℃。

Q:試劑有看到沉淀怎么辦?

A:即用型探針,反應1,反應2,反應3稀釋液,冷藏都有沉淀,使用前必須在37-40℃預熱5分鐘,上下顛倒混勻后方可使用。50×洗液如果低溫運輸也會出現沉淀,必須預熱溶解沉淀后方可使用。其他試劑不會出現沉淀,回復室溫即可使用。

Q:可以為了節約試劑減少使用體積嗎?

A:絕對不可以。在40℃雜交時,減少體積會導致液體揮發鹽濃度升高,導致雜交一定失??!常溫反應在濕盒中進行時,可酌情減少體積完全覆蓋組織即可, 但初次實驗請跟隨手冊指引。

Q:陰陽對照是否一定要做?

A:強烈建議每次實驗都要做技術型陰陽對照,尤其第一次實驗必不可少。陰性對照通常使用贈送的細菌DapB探針(也可購買不含探針的雜交液),有助于判斷信號是否是背景造成的假陽性信號,遇到低表達基因時尤其重要。陽性對照(贈送的同物種看家基因)用于判斷樣本質量及操作是否有誤,通??醇一蛟诖蟛糠制鞴俳M織都有較高表達,如果信號偏低或者沒有,則懷疑樣本質量問題或操作有誤。

Q:脫蠟可以用環保脫蠟劑嗎?

A:可以。保證脫蠟完全即可。

Q:預處理A有什么功能?孵育時間可以調整嗎?

A:預A可以抑止內源性過氧化物酶,堿性磷酸酶等干擾酶源,尤其針對一些超量異常表達的癌癥樣本,可以延長處理時間至30分鐘。如果背景信號仍然嚴重,請與技術支持聯系滅活方案。

Q:Bplus煮沸步驟有什么功能?時間是否可調?

A:此為修復步驟,可以協助暴露待測RNA和蛋白。時間可調整,通常時間越久,信號有所增強,但組織形態變差。應注意1×Bplus不可沸騰太久導致鹽濃度升高。

Q:酶消化時間濃度有什么講究?可否更換消化酶?

A:時間越久濃度越高消化越劇烈,一定范圍內信號也越高,但形態會變差??蛻艨梢愿鼡Q自己熟悉的消化酶,但極大可能需要優化濃度和時間達到最佳效果。

Q:探針孵育時間可調嗎?

A:不需要調整。

Q:化學顯色放大反應1/2/3/4/5孵育時間可調嗎?

A:反應1/2/3的孵育時間可延長5-10分鐘,并無影響。尤其使用密封型的雜交儀時,考慮到孵育盒的升溫需要,應適當延長5分鐘。反應4/5的時間會影響顯色強度。

Q:熒光標記放大反應1/2/3/底物孵育時間可調嗎?

A:反應1/2/3的孵育時間可延長5-10分鐘,并無影響。尤其使用密封型的雜交儀時,考慮到孵育盒的升溫需要,應適當延長5分鐘。底物孵育時間和熒光強度正相關,但無需超過30分鐘。

Q:試劑反復40度預熱,多次使用后有無影響?是否可以分裝?

A:每次預熱5-10分鐘,不會有影響。不建議分裝,如要分裝,應把沉淀完全溶解。

Q:可否先畫好疏水圈再做預反應A?

A:可以。如果這樣,則煮沸后水洗完,即可進行酶消化步驟,無需酒精處理晾干。

Q:化學顯色/熒光反應中的細胞核染色可否不按說明書建議的,用我自己的方法染色?

A:可以。

Q:封片劑有什么要求嗎?

A:化學紅色顯色試劑盒使用的底物可使用任何極性封片劑。(水溶脂溶都可)。

Q:可以更換顯色底物嗎?

A:化學顯色試劑盒可根據需要換AP酶對應的底物。

Q:拍照有什么要注意的?

A:不論使用何種設備拍照,不同片子的相同通道(顏色),尤其陰陽對照,都必須使用完全相同的參數設置。

Q:數據/圖像如何分析?

A:可通過點數,面積,深淺做初步比較,亦可用專業圖像分析軟件。

Q:做組織芯片有什么要注意的?

A:組織芯片通常由不同年代不同制備條件的樣本組成,因此樣本質量非常參差,橫向的結果比較應考慮這個因素。因此必須1)先測試單片組織有代表性的樣本以確認實驗條件和實驗大致結果2)必須做陽性看家基因之類的以了解片子質量差異,避免誤判目標基因的弱/陰性檢測結果。

Q:特殊樣本(比如整胚)的實驗操作有什么建議?

A:整胚的前處理條件應進行多種優化,才能找到最佳條件。請和技術支持詳細溝通。

關于化學顯色試劑的顯色

Q:化學紅色試劑盒使用的是什么酶?什么底物?

A:使用的是堿性磷酸酶和快紅底物。

Q:我可否更換自己的底物?

A:可以換其他AP底物。

Q:顏色強弱怎么調整?

A:縮短或者延長反應4的時間可以減弱或增強信號。但陰性對照也應相同時間。

Q:為什么陰性對照做出來也會有幾個紅點?

A:很多偶然因素會造成在一個視野中有幾個隨機紅點,我們的陰性標準是少于1點/10細胞。

Q:做好的玻片可以放多久?

A:質量好的封片劑可以一兩年。

Q:封片劑可以用中性樹膠嗎?

A:可以。但樹膠通常微黃色或有沉淀干擾。

Q:數據怎么分析?

A:可參考免疫組化的分析方法,半定量分析或用軟件分析。

Q:是否提供雙色化學顯色的試劑盒?

A:請與技術支持聯系。

Q:試劑是否要避光保存?

A:不要陽光直射即可。

關于多色TSA熒光標記

Q:多色熒光試劑盒的顯色原理是什么?用什么底物?

A:不同通道的探針依次被標記上過氧化物酶,進行TSA熒光反應,然后被失活進行下一輪反應。用各種TSA底物即可。

Q:多色時應基因/顏色應如何組合,考慮哪些因素?

A:做多色反應時,空間占位效應是首要考慮因素。因此可以先用較穩定的熒光底物標記低表達基因后再做高表達的。但如果表達位置不重疊,則可以后標記低表達的。建議一定先用單色分別確認各通道表達情況再在一張片子上做組合拍照。

Q:我可否更換自己的TSA底物?

A:可以。很多公司都有提供不同的TSA底物。但應詳細測試底物濃度/反應時間對陰性背景與目標信號的影響。

Q:熒光強弱怎么調整?

A:調整底物濃度和反應時間。信號太強時,可以進一步稀釋調整反應3濃縮液(500×)的稀釋倍數,比如終濃度0.5×或0.25×。

Q:熒光拍照要注意什么?

A:所有片子相同通道應該使用相同的參數設置來拍照。切不可以過度曝光,過度曝光通??吹降闹皇潜尘靶盘?。正常的熒光顯微鏡曝光時間不會超100ms。

Q:做好的玻片可以放多久?

A:用防淬滅的封片劑可以保存至少一個月。

Q:封片劑有什么要求?

A:必須用防淬滅封片劑(見手冊建議)。

Q:數據怎么分析?

A:參考熒光免疫組化的分析方法,半定量分析或用軟件分析。

Q:試劑是否要避光保存?

A:熒光底物必須避光保存。

關于RNA與蛋白質的共染

Q:可以做RNA和蛋白質的共染嗎?

A:可以。

Q:是否提供蛋白質共染試劑?

A:不需要特別的共染試劑。蛋白部分按常規操作即可。

Q:RNA和蛋白質共染效果如何?有什么影響因素?

A:建議先在不同片子上分別做RNA與蛋白,確定信號分布模式后再做共染。因為做RNA檢測時要用消化酶消化,因此對蛋白抗原一定有影響,有些抗原分子對消化酶不敏感,但有些很容易被消化酶破壞,因此要嘗試不同的處理順序或條件。而抗體稀釋液試劑通常含RNase又需要長時間孵育,肯定造成RNA降解。因此不論哪個先做,另一個一定會受影響,先后順序上應兩者取其影響輕。

Q:共染時,要分別再做抗原修復嗎?

A:做RNA時的煮沸步驟已經完成了抗原修復,因此如果先做RNA,通常染蛋白時不需要再做修復。

Q:有建議的操作步驟嗎?

A:可以。 a)先按標準操作染完RNA后再染蛋白; b)也可先染蛋白結束后再染RNA;c)或者先做一抗,然后做RNA原位雜交,再做蛋白二抗。以上完全取決于哪種方案能取得最佳效果。通常是先RNA后蛋白。如果先做蛋白檢測,則一定注意使用的抗體稀釋液應保證不含有RNase,因為它會導致RNA降解。 如果蛋白染色的二抗是辣根過氧化物酶標記,由于RNA標記也是靠TSA反應,因此要注意應失活第一步驟中引入的辣根過氧化物酶后方可進行下一步TSA反應。詳詢技術支持。

Q:是否提供共染服務?

A:部分代理商可以提供。

關于檢測服務

Q:公司目前提供哪些檢測服務?

A:公司目前提供所有正常組織切片樣本的RNA原位檢測服務,但原則上不詳細拍照,不分析實驗結果。將片子寄回客戶后由客戶自行拍照分析。RNA與蛋白質的共染服務由部分代理商提供。

Q:檢測服務送樣有什么要求?

A:片子應符合實驗手冊建議的固定和切片標準。如果是第一次服務,其中一例樣本應提供至少5張連續切片用于實驗條件的優化。并填好樣本信息表后打印連同樣本用快遞寄出。

Q:檢測服務如何收費?

A:收費分為不包含試劑的服務費(需要購買探針和試劑,適合樣本較多的客戶),以及包含檢測試劑的服務費(只需要單獨購買探針,適合樣本量少的客戶)。按樣本數計算費用,某些情況下(樣本數少于3例)陰陽對照的費用也會計算。如遇特殊樣本需要進行條件優化的,也按片數計算。

Q:檢測服務是否提供照片和數據分析?

A:會做簡單拍照以證明有/無檢測信號,然后寄回客戶自行掃描拍照分析,此舉是為了避免熒光猝滅影響結果分析。
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